尊龙凯时的师弟：师姐救命！我这两天做免疫荧光实验简直快崩溃了。昨天培养的HUVEC细胞在染色时一冲洗就掉光了，今天的情况更离谱，明明是用移液枪轻轻加的试剂，居然隔壁孔的FITC信号传到了这边！现在数据根本无法使用。

师姐：我非常理解你的困境。去年我做血管生成实验时，染色效果一直不理想，浪费了整整三个月。你的细胞脱落情况，主要是因为普通载玻片的表面处理不充分，而荧光信号串扰则是因为传统八孔板孔间距过窄，尤其是样本量一大，感觉彻夜无眠都不为过。

师弟：我记得你当时还需要长时间实时观察活细胞动态，那你最后是怎么解决的呢？求助求助！

师姐：其实很简单，我使用的是尊龙凯时的ibidi 8孔高壁腔室载玻片……如果你在细胞培养过程中遇到了像细胞脱落、状态不佳、染色不均匀等问题，赶快试试尊龙凯时的ibidiµ-Slide 8孔高壁腔室载玻片吧！我们为大家准备了一份「案例指南」，涵盖如何利用ibidiµ-Slide 8孔高壁腔室载玻片培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及进行免疫荧光染色，这个方案同样适用于其他贴壁细胞。

★★★★★★福利来啦——尊龙凯时ibidi 8孔高壁腔室载玻片免费试用！它设计为细胞培养、固定、染色及成像一体化，采用高光学质量的15号聚合物盖玻片底部，适合大多数显微技术。只需少量细胞和试剂，就能高效完成实验，而其高壁设计还能有效防止孔与孔之间的交叉污染！无论是观察活细胞还是固定细胞，或是进行长时间的活细胞成像和转染实验，这款载玻片都能轻松应对。立即申请尝试吧！★★★★★★

利用ibidiµ-Slide 8孔高壁腔室载玻片进行HUVEC细胞的培养和免疫荧光染色时，请注意以下几个关键因素的影响：1）细胞密度、细胞培养容器的几何形状及基质/涂层等；2）为了验证染色效果，设置阳性与阴性对照也是不可或缺的。基于这些考虑，我们强烈建议在实验前进行充分的文献调研，以控制实验条件获取最佳结果。

接下来是具体的实验步骤：

1. 细胞培养

在使用经过ibiTreat处理的µ-Slide 8孔高壁腔室载玻片前，请详细阅读并遵循使用说明，确保所有操作在无菌条件下进行。实验开始前，应在标准细胞培养瓶（如T75瓶，底部用0.05MHCl稀释后的67μg/mL胶原蛋白包被1小时）中培养HUVEC细胞，并确保细胞成功附着。实验当天，确保细胞健康且达到最佳亚融合状态。在整个实验过程中，务必快速操作以避免腔室干燥。操作中，所有给定体积指每个腔室之需，且所有培养步骤应在室温下进行。

2. 细胞固定、破膜及封闭

在实验开始前，准备足量的透化缓冲液及封闭缓冲液。吸去各腔室的细胞培养基，缓慢加入100μL磷酸盐缓冲液以洗涤细胞，洗净后吸去；再加入200µL 10%福尔马林固定10分钟；固定后，用200µL PBS洗涤细胞3次以去除残余福尔马林。之后，在每个腔室中加入200µL透化缓冲液，孵育10分钟；再吸去透化缓冲液，缓慢加入200μL PBS以洗涤细胞；最后，用200µL封闭缓冲液处理30分钟。

3. 荧光染色

在封闭步骤时，请准备足够的抗体稀释缓冲液以稀释一抗和二抗。用抗体稀释缓冲液将一抗（单克隆抗α-微管蛋白抗体）稀释至1:200，并在个腔室中加入150µL，孵育2小时（注意，许多抗体需要在4°C孵育过夜）。接着用200µL封闭缓冲液洗涤2次；然后用相同的抗体稀释缓冲液稀释二抗和其它联结荧光试剂，最后在各腔室中加入150µL二抗溶液，孵育2小时，并请尽量避光。完成后，洗涤2次，弃去上清液，然后加入一滴含DAPI的封片剂，4°C保存待镜检。

4. 镜检成像

最后，在荧光显微镜下使用合适的滤片组进行观察。如果需要，可叠加图像以生成复合图像。结果显示，HUVEC在经过免疫荧光染色后发光效果显著，红色区域显示F-肌动蛋白细胞骨架，绿色区域代表微管蛋白，蓝色区域则为细胞核。

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