硬纤维瘤，又称为侵袭性纤维瘤病，是一种具有局部侵袭性的肿瘤。尽管其不具备转移性，但复发率高，极大地影响患者的生活质量。目前，关于硬纤维瘤的分子机制研究仍显不足，限制了患者的治疗选择。本文旨在开发新的预后标志物，并对先前报道的相关标志物进行验证，同时深入探究硬纤维瘤在基因组、表观基因组和转录组层面的分子异质性，为精准治疗提供基础理论支持。

研究方法与结果显示，此次研究对20例原发性硬纤维瘤的31个样本进行了RNA-seq分析。结果发现，有14个基因在复发和未复发患者之间存在差异表达，但在患者组内及同一肿瘤不同区域的表达具有高度可变性。此外，先前文献中报告的几项预后基因表达特征经过验证后发现，患者之间以及同一肿瘤内的基因表达显著存在异质性。例如，在Salas研究的36个基因特征中，仅FECH基因在复发与未复发肿瘤中展现显著的表达差异，且结果与原研究有出入。而Kohsaka研究中的IFI6和LGMN基因在本研究中未能显示出与复发相关的差异表达，同一肿瘤内部的表达亦表现出异质性。通过蛋白质水平的免疫组化（IHC）验证了这些标志物的可变表达，且未与局部复发呈现明显关联，从而进一步证实基于基因表达特征的预后分类受到肿瘤取样区域影响。

在详细分析患者样本时，发现患者1的原发性和复发性肿瘤均存在CTNNB1基因的T41A突变，复发性肿瘤的两个区域还存在S45P突变，且其变异等位基因频率（VAF）不同。系统发育分析显示，原发性肿瘤存在三个不同亚克隆，复发性肿瘤则新增两个亚克隆，并且复发性肿瘤共享PTP4A1基因的突变，其RNA表达低于原发性肿瘤中的野生型区域。相较于原发性和复发性肿瘤，DNA的拷贝数变化较少，但DNA甲基化和转录组特征则显著不同，原发性肿瘤的某一区域展现出了独特的转录组特征，富集与线粒体氧化磷酸化途径相关的基因，部分基因的表达则与甲基化呈负相关。

另外，患者2的原发性与复发肿瘤均携带CTNNB1 T41A突变，第三次复发时出现了三个新的DNA突变（MKI67、MYOF和HAUS1），其中MYOF突变在RNA-seq中得到了验证，而HAUS1亚克隆突变也在第二次复发的某一区域被发现。原发性与复发性肿瘤中显示出多个克隆和亚克隆的DNA拷贝数变化，同时DNA甲基化谱表现出不同的聚类情况，转录组分析显示原发性肿瘤与第二次和第三次复发肿瘤的转录组谱差异显著，尽管第二次复发肿瘤的某一区域与原发性肿瘤的表现相似。

对于患者3而言，原发性和大多数复发性肿瘤均携带CTNNB1 S45F突变，而在第二次复发的某样本中并未检测到该突变，但RNA-seq确认其存在。第一次与第二次复发的某一区域则观察到大量局灶性DNA拷贝数变化，第二次复发肿瘤的表观基因组谱与其他样本显著不同，原发性肿瘤和第一次复发肿瘤在转录组层面展现出高度的肿瘤内异质性，第三次复发肿瘤则富集了12个与缺氧相关的基因。

总结而言，该研究首次系统地揭示了硬纤维瘤在基因组、表观基因组和转录组层面的高度肿瘤内与肿瘤间异质性。这表明，基于单一肿瘤活检的分子分析可能低估了硬纤维瘤的分子改变程度，而预后转录组特征则极易受到取样偏差的影响。同时，复发性硬纤维瘤获得了原发性肿瘤中所未见的多种分子改变，这提示肿瘤在其发展过程中经历了分子进化，对药物研发和生物标志物验证具有重要意义。

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