产品名称：pCR-BluntII-TOPO-ZNF541（human）质粒

产品规格：05微克质粒干粉

在收到产品后，请首先根据产品管壁标签确认其形式，并在扩增前准确查询该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。以下是pCR-BluntII-TOPO-ZNF541（human）质粒的扩增流程。

质粒干粉操作步骤

质粒干粉在常温下运输，存储于-20摄氏度，保质期为90天。请务必进行转化并挑取单克隆培养，禁止直接使用和测序。

1. 收到质粒干粉后，先进行5000rpm离心1分钟，然后加入20μl去离子水（ddH2O）溶解质粒。
2. 取1支100μl感受态细胞在冰上解冻10分钟，加入2μl质粒，冰浴30分钟后，42°C热激60秒，随后再次冰浴2分钟。（从第二步开始均需在超净工作台进行无菌操作）
3. 向反应体系中加入900μl无抗LB液体培养基，37℃、180rpm震荡培养45分钟。
4. 以6000rpm离心5分钟，仅保留100μl上清液重悬细菌沉淀，并将其涂布至目标质粒的抗性LB平板上；建议使用本平台的专用涂布玻璃珠，以提高转化子数量。
5. 将平板孵育1小时后，倒置在37℃下培养14小时；如果需要在30℃培养，则应延长至20小时（若菌落增长过多，可先稀释质粒再转化；若没有菌落，则加入10μl质粒进行转化。请注意，不要直接转化感受态，而需先进行克隆转化，提取质粒后再导入表达感受态）。
6. 挑取单个菌落至LB液体培养基中，加入相应抗生素，在220rpm条件下震荡培养14小时，随后根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

其他菌种形式及处理方法

尊龙凯时提供多种不同形式的菌种，处理方式如下：

• 甘油菌种：运输使用冰袋，存放于-80℃，保质期为90天。请务必划线挑选单克隆进行培养。
• 穿刺菌种：运输使用冰袋，存放于4℃，保质期为7天。进行穿刺接种后，液体培养，再进行四区划线挑选单菌落进行液体培养。
• 菌落平板：直接挑取单个菌落至液体培养基中。
• 液体质粒：运输使用冰袋，存放于-20℃，保质期为90天。收到后可直接使用。
• 滤纸质粒：在常温下运输，存放于-20℃，保质期为90天。请务必转化并挑选单克隆进行培养，禁止直接使用和测序。

质粒提取原理及操作步骤

质粒提取采用碱裂解法，根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异进行分离。在pH值约为12-12.5的条件下，线性DNA双螺旋结构解开，氢键虽被断裂但环状质粒DNA的互补链依然保持紧密结合。当添加pH 4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复至中性时，复性迅速而准确地形成环状质粒，而线性DNA则能形成网状结构，通过离心去除沉淀，从而实现分离提取。

质粒提取操作步骤：

1. 准备20ml灭菌培养管，编号并加入8ml LB培养基及8μl相应抗生素。
2. 使用10μl枪头挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡培养过夜（274rpm）。
3. 将2ml过夜培养的菌液加入离心管，室温10000rpm离心2分钟，去除上清液。
4. 向含有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer P1（含RNaseA），充分混匀以悬浮菌体。
5. 向离心管中加入250μl Buffer P2，轻柔地上下颠倒混匀4-6次以获得澄清的裂解液。
6. 向离心管中加入350μl Buffer N3，轻柔上下颠倒混匀4-6次，室温10000rpm离心15分钟。
7. 小心将上清液转移至洁净的吸收柱中，确保没有沉淀和细胞碎片，室温10000rpm离心1分钟，去掉废液。
8. 向吸附柱中加150μl Buffer PB，10000rpm离心1分钟，倒掉废液。
9. 向吸附柱中加400μl Buffer PW（确保加入无水乙醇），10000rpm离心1分钟，倒掉废液，并再次空离2分钟（此时建议加热Buffer EB至65-70℃）。
10. 将吸附柱置于新的离心管中，打开盖子，吹风约4分钟以去除乙醇。
11. 向吸附柱的膜中间添加90μl Buffer EB（pET系列低拷贝数时加70μl），室温静置2分钟，10000rpm离心1分钟。
12. 液体倒回吸附柱中，再次10000rpm离心1分钟。
13. 将质粒混合于一个新离心管中，做好标记，开盖室温放置约两小时，并于-40℃保存质粒。

注意事项

使用之前，请将试剂盒中的RNA酶添加至Buffer P1，并存放于4℃。建议将Buffer EB预热至65-70℃以提高提取效率。

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